生物通報(bào)道：RNA干擾（RNAi）可以幫助人們特異性關(guān)閉基因的表達(dá)，是生物學(xué)領(lǐng)域的常用技術(shù)。本文介紹了一些實(shí)用工具和小竅門，希望能幫你優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使RNAi更加。

新轉(zhuǎn)運(yùn)工具

免費(fèi)索取一代細(xì)胞增殖檢測技術(shù)資料信息，無需抗體，輕松獲取更加準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

為了能夠簡單有效的轉(zhuǎn)運(yùn)干擾性RNA（如siRNA、shRNA、miRNA和ncRNA），各大公司紛紛推出了新的分子工具。

siRNA

舉例來說，Polyplus Transfection公司的INTERFERin®-HTS平臺專為高通量的siRNA轉(zhuǎn)染而設(shè)計(jì)，支持自動化的液體處理系統(tǒng)。在高通量研究中，“siRNA與轉(zhuǎn)染試劑形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合體，往往需要穩(wěn)定存在幾個小時，”Polyplus的CEO Mark Bloomfield說。

為此，Polyplus提供了兩款改良型siRNA用于活體轉(zhuǎn)染。其中STICKYSIRNA™可以增加siRNA-轉(zhuǎn)運(yùn)試劑（in vivo-jetPEI®）復(fù)合體的穩(wěn)定性。而SIRNAPLUS™則不需要轉(zhuǎn)運(yùn)試劑，其轉(zhuǎn)運(yùn)載體就整合在siRNA分子上。

IDT（Integrated DNA Technologies）公司也推出了siRNA新產(chǎn)品，即由pre-designed siRNA組成的Dicector文庫。這一新產(chǎn)品是DsiRNAs（Dicer-substrate siRNAs）產(chǎn)品線的新成員。Dicector DsiRNAs的設(shè)計(jì)采用改良后的算法，可以靶標(biāo)所有的人類、小鼠和大鼠基因。shRNA

siRNA一般進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，而shRNA往往被結(jié)合在病毒或細(xì)菌載體上，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。不過，由于shRNA隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，其表達(dá)水平并不穩(wěn)定。

為了解決這一問題，Sigma Aldrich公司開發(fā)了一個試劑盒，可以將shRNA插入到基因組的特定位置。據(jù)Sigma公司的Shawn Shafer介紹，這一靶向整合試劑盒采用鋅指核酸酶技術(shù)，將shRNA插入到人類基因組的AAVS1位點(diǎn)。這一技術(shù)將shRNA定位在一個地方，使影響shRNA表達(dá)水平的一個重要變量固定下來。

Thermo公司致力于尋找促進(jìn)shRNA表達(dá)的啟動子。“啟動子性能不強(qiáng)會導(dǎo)致knockdown效果不佳，而讓人誤以為shRNA沒有功能或者轉(zhuǎn)導(dǎo)效率太低。實(shí)際上可能只是shRNA的表達(dá)水平不夠，” Thermo公司的Louise Baskin說。

Thermo公司提供的SMARTchoice shRNA平臺整合了GFP，讓用戶能夠在同一種細(xì)胞中比較多個啟動子的性能。啟動子能使系統(tǒng)產(chǎn)生zui強(qiáng)的GFP信號。

反義RNA

IDT也為靶標(biāo)細(xì)胞核非編碼RNA（ncRNA）提供了工具。對于ncRNA來說，siRNA的knockdown效果往往并不理想，而反義寡核苷酸ASO更能發(fā)揮作用。據(jù)介紹，這可能是因?yàn)?/span>siRNA主要在細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用，而ASO更適合作用于細(xì)胞核。

與siRNA相比，ASO不僅能夠激發(fā)RNase H的活性，脫靶效應(yīng)也更低。該技術(shù)*的問題在于，目前還沒有足夠成熟的設(shè)計(jì)軟件。

近來，長非編碼RNA（lncRNA）一直是研究的熱點(diǎn)，ASO技術(shù)很適合對其功能進(jìn)行研究。QIAGEN公司的Eric Lader指出，在用RT-qPCR對這類實(shí)驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果分析時，需要更多的生物信息學(xué)支持。因?yàn)榕c蛋白編碼基因數(shù)據(jù)庫相比，lncRNA序列數(shù)據(jù)庫還不那么成熟。

如何讓knockdown更加可靠!--?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /--

無疑，RNAi需要在健康的細(xì)胞中進(jìn)行。Bloomfield建議大家使用傳代不超過20次的細(xì)胞。此外，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞類型，也會影響RNAi的轉(zhuǎn)運(yùn)工具。“沒有一個對所有細(xì)胞系都適用的轉(zhuǎn)運(yùn)方案，因此我們在嘗試新細(xì)胞類型時要謹(jǐn)慎選擇RNAi工具，”Baskin說。另外，不論何時都應(yīng)考慮到RNA轉(zhuǎn)運(yùn)對細(xì)胞的毒性，在毒性與轉(zhuǎn)運(yùn)效率之間尋求平衡。

在用抑制性RNA進(jìn)行knockdown之后，一般要通過mRNA和蛋白的水平，來檢測RNAi的效率。這時，選擇合理的對照非常重要，陰性對照一般采用非靶向性的RNA，而陽性對照往往靶標(biāo)的是看家基因（如GAPDH、PPIB或 HPRT）。

實(shí)際上，RT-qPCR對結(jié)果的影響很大。“適當(dāng)?shù)年栃?/span>/陰性對照，合理的RT-qPCR分析，都決定著knockdown效果的重現(xiàn)性，”Lader說。“80% knockdown與50% knockdown之間的差異，對于實(shí)時定量PCR來說，只是一次循環(huán)中的一點(diǎn)變化。”

在判定knockdown效果時，表達(dá)時機(jī)也很重要。“可以根據(jù)蛋白和目標(biāo)mRNA的半衰期，在轉(zhuǎn)染后24到96小時之間，確定進(jìn)行結(jié)果分析的時間段，這樣才能更好的解讀基因沉默的效果，”Bloomfield說。

Baskin指出，RNAi分析中有一個常見的誤區(qū)，就是希望目標(biāo)的knocked down程度與陽性對照（看家基因）相同。“不是所有的目標(biāo)基因都以同樣的方式表達(dá)，也不是所有的RNAi試劑都與陽性對照一樣強(qiáng)力，”他說。

“越來越多的數(shù)據(jù)顯示，在不同細(xì)胞類型中使用同樣的RNAi試劑，會產(chǎn)生不同的基因沉默效果和脫靶效應(yīng)，”Baskin說。因此專家建議，為了保證RNAi的效果，每個細(xì)胞系都應(yīng)該進(jìn)行條件優(yōu)化。事實(shí)上，同一個細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效率可能也不穩(wěn)定，的辦法是，每一次RNAi都使用陰性和陽性對照。