明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒（MMP2/9）如何正確使用！

信帆生物供應(yīng)明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒（MMP2/9），歡迎廣大用戶前來(lái)咨詢！

產(chǎn)品名稱：明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒（MMP2/9）

產(chǎn)品規(guī)格：50T

產(chǎn)品組成：

A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC；

B. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC；

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液, 4 oC。

實(shí)驗(yàn)步驟（僅供參考）：

1.制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 oC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2. 待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。

陽(yáng)性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。

注：因?yàn)槿煞謴?fù)雜,MMP活性較低，好的方法是將全血中白蛋白進(jìn)行分離做陽(yáng)性對(duì)照

3.低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 18 小時(shí)，中間換液。如MMP 活性低，Buffer A 孵育時(shí)間可延長(zhǎng)至36-48小時(shí)，中間24小時(shí)換液一次。

5 .孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37oC 孵育1~5 小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照或者血中的MMP 通常37oC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過(guò)夜。

6..顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見(jiàn)后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。

透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽(yáng)性對(duì)照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色。

本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)用，不做其它用途！