為了提高ELISA的檢測速度，使之更方便地應(yīng)用于科研及現(xiàn)場調(diào)查工作，根據(jù)ELISA的實(shí)驗(yàn)原理，我們設(shè)計(jì)了一種ELISA試劑盒，并應(yīng)用于血吸蟲病人血清抗體的檢測，現(xiàn)報(bào)告如下。

　　1　材料與方法　①日本血吸蟲成蟲抗原的制備　以1500條日本血吸蟲尾蚴經(jīng)皮膚感染家兔，45天后經(jīng)門靜脈灌注收集成蟲，用生理鹽水洗滌后用玻璃勻漿器勻漿，以12000×g離心，收集上清液，測定其蛋白含量。②酶聯(lián)SPA結(jié)合物　購自上海生物制品研究所，臨用前用1ml PBS溶解。③血清　50份日本血吸蟲病人血清來自江西省血吸蟲病流行區(qū)，臨用前分別用1∶2，1∶10；1∶20；1∶40的HRP-SPA液將血清稀釋到1∶50的濃度。④ELISA快速法的建立　用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋日本血吸蟲成蟲抗原至80μg/ml，每孔50μl包被酶標(biāo)板，4℃放置過夜，第二天用PBS洗滌三次后用含1%BSA的PBS液于37℃封閉45min，用PBST(含0.05%Tween-20)洗板三次；在酶標(biāo)板孔中分別加入用不同稀釋度的酶聯(lián)SPA稀釋到1∶50的病人血清50μl，37℃反應(yīng)60min，再用PBST洗板三次，加入底物鄰苯二胺應(yīng)用液50μl，37℃顯色10min，加入2mol/L的硫酸溶液中止反應(yīng)，觀察結(jié)果，尋找zui適的酶聯(lián)SPA液的工作濃度。⑤檢測血吸蟲病人血清抗體　方法同④，酶聯(lián)SPA的工作濃度為1∶40，病人血清的稀釋度為1∶50。⑥常規(guī)ELISA檢測血吸蟲病人血清抗體　按常規(guī)方法［1］，以每孔50μl日本血吸蟲成蟲抗原包被酶標(biāo)板，4℃放置過夜，第二天用PBST洗板三次后用含1%BSA的PBS 37℃封閉1小時(shí)，用PBST洗板后加入1∶50稀釋的病人血清，37℃反應(yīng)60min，用PBST洗板三次，再加入1∶40稀釋的酶聯(lián)SPA，37℃反應(yīng)60min，洗板后加入底物鄰苯二胺應(yīng)用液，37℃顯色10min，用2mol/L的硫酸終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

　　2　結(jié)果與討論　常規(guī)的ELISA檢測血清抗體的方法是將已知的抗原包被在酶標(biāo)板上，與血清中待測抗體結(jié)合后通過加入酶聯(lián)抗人IgG(HRP-IgG)或酶聯(lián)SPA(HRP-SPA)顯色的兩個(gè)過程來完成的。HRP-SPA與血清中待測抗體結(jié)合的位點(diǎn)是Ig的Fc段，從理論上講HRP-SPA與Ig的Fc段結(jié)合不會影響Ig的Fab段與抗原的結(jié)合，或者影響很小，因此可以設(shè)想將抗原與待測抗體反應(yīng)的過程，待測抗體與酶標(biāo)二抗反應(yīng)過程在同一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行，從而使整個(gè)反應(yīng)過程減少一步，Sundaram等［2］根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)了偶聯(lián)探針Western blot方法，取得了好的實(shí)驗(yàn)效果，我們依據(jù)相同的原理，設(shè)計(jì)了ELISA快速法，用于檢測血吸蟲病人血清抗體。用該法及常規(guī)ELISA同時(shí)檢測50份江西省血吸蟲病流行區(qū)病人血清標(biāo)本，49份結(jié)果陽性，1份標(biāo)本為陰性，陰性標(biāo)本均為第7份標(biāo)本，兩種方法的檢 測結(jié)果*一致。

　　抗原與待測抗體反應(yīng)的過程，待測抗體與酶標(biāo)二抗反應(yīng)過程在同一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行，因病人血清中存在的非目標(biāo)檢測抗體會消耗一部分HRP-SPA，為達(dá)到常規(guī)ELISA檢測的敏感度，則可能需要增加HRP-SPA的用量，通過測定HRP-SPA的工作濃度與可檢測出血清抗體滴度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)分別按1∶2，1∶10，1∶20，1∶40稀釋的HRP-SPA，能測出混合陽性血清zui高滴度均為1∶12800，與常規(guī)的ELISA的檢出滴度相同，因此ELISA快速法并不需要增加HRP-SPA的用量，常規(guī)使用時(shí)只要按廠家推薦的1∶40的工作濃度使用即可獲得滿意的使用效果。

　　ELISA快速法的抗體檢測效果與常規(guī)ELISA相同，檢測條件亦一致，檢測時(shí)間則可明顯縮短，可顯著提高工作效率，對提高抗血吸蟲抗體以及其它血清抗體檢測方法的檢測速度方面將會有一定的實(shí)用價(jià)值。