細胞組分的分離與純化

研究人員對細胞組分進行分級分離的原因有很多。他們可能希望，當感興趣的蛋白在某些條件下或某種處理之后轉位時，對其進行追蹤；或者是獲得有活性的亞細胞結構構建無細胞體系，從而在體外對一些復雜的生物學過程進行模擬研究；抑或是分離相當純度的亞細胞器用于電泳或色譜分析，從而建立相應的亞細胞器蛋白質組數(shù)據(jù)庫。細胞組分的分離與純化分為傳統(tǒng)的離心分離純化法，以及親和純化-免疫磁珠分離純化法，具體如下。

1、離心分離純化法

離心方法，包括差速離心法和密度梯度離心法，密度梯度離心法又分為速度-區(qū)帶密度梯度離心法和等密度梯度離心法。

在選用合理的方法對細胞或組織進行破碎后，首先要進行差速離心法，即根據(jù)不同離心速度所產(chǎn)生的不同離心力將各種細胞組分和顆粒分離開來。各種細胞器和顆粒典型的差速離心順序見下表。

經(jīng)過多次復雜的差速離心也可純化各種亞細胞器，但常常是事倍功半，很大的離心工作量，卻得到不太高的純度。此時，可以將差速離心得到的沉淀物再進行密度梯度離心進一步純化。

在速度區(qū)帶離心中，由于不同組分顆粒在梯度液中沉降速率的差別，而在離心的某一時刻形成了數(shù)個含有單一組分顆粒的區(qū)帶。

樣品在離心后與梯度液一起收集，用常規(guī)技術去除梯度液后就得到了某個較純的成分。每個單一組分的沉降速率取決于它們的形狀、尺寸、密度、離心力的大小、梯度液的密度和粘性系數(shù)。

與速度區(qū)帶離心法不同，等密度梯度離心是根據(jù)細胞組分顆粒的不同密度來進行離心分離的，即根據(jù)組分顆粒的浮力。

細胞組分沉淀可以鋪在梯度液之上，也可置于梯度液之下，甚至和梯度液混在一起。在離心過程中由于組分顆粒各單一成分向各自的等密度區(qū)靠攏即達到了分離純化的目的。

根據(jù)以往文獻報道，分離純化各種細胞組分顆粒推薦使用的密度梯度介質和離心條件如下表。

綜上所述，離心法分離純化細胞組分可以一次性對大量的細胞或組織粗提液進行分離純化，并將其富集濃縮成較小的體積以適應后續(xù)的分析研究。

但也存在一定的局限性，具體表現(xiàn)在：*，差速離心法貼壁效應嚴重，常在離心管的一側出現(xiàn)沉淀，導致顆粒被擠壓變形而失活；第二，無法將具有相似密度、大小的不同細胞器分離開來，例如微粒體和過氧化物酶體等；第三，對于異質型細胞器（即具有不同密度、大小的同一類變異細胞器）無法兼顧，只能選擇收集某一密度范圍的，對于其他密度的只能丟棄；第四，離心所需要的超速離心機及相匹配的轉子對于一些小型的實驗室來說可能并不容易達到。

細胞組分的分離與純化

2、親和-免疫磁珠純化分離法

免疫磁珠或稱免疫磁性微球，具有超順磁性，可通過抗體與靶細胞器特異性結合并使之具有磁響應性。將免疫磁珠與待分離的混合物共同孵育，免疫磁珠就可通過抗原抗體反應選擇性地與靶細胞器物質結合，當此復合物通過一個磁場裝置時，與免疫磁珠結合的靶細胞器就會被磁場滯留，從而與其他復雜物質分離開來。

用于細胞組分分離的免疫磁性微球必須具備以下條件：

1）化學性能穩(wěn)定，不產(chǎn)生凝聚；

2）不與細胞發(fā)生非特異性的結合；

3）磁性微球與抗體的結合牢固；

4）磁性微球的大小均勻，磁響應性好，磁性納米材料的含量均勻一致；

5）磁性微球大小適當，對于較小的細胞器宜選擇較大的磁珠，以確保兩者之間的相互作用更牢固。

對于免疫分離技術來說，特異性抗體的選擇非常關鍵。抗體必須能夠特異性識別并且能夠到達位于靶細胞器上的抗原表位。

如果抗原表位被包埋在細胞器的內部，則與磁珠相結合的抗體可能就很難達到。據(jù)此，免疫分離可以分為直接和間接兩種方法。

若抗原表位位于靶細胞器的表面，通常采用直接法，即將特異性抗體直接與磁珠或包被有二抗的磁珠相結合，然后再加入待分離的細胞粗提物進行親和純化。

直接法的分離速度和效率相對來說較好。但若抗原表位被包埋在內部，則更適合使用間接法。即特意習慣抗體先與待純化的細胞粗提物混合，然后再加入包被有二抗的磁珠，將抗體-靶細胞器復合物進行免疫分離。

當磁珠-靶細胞器復合物形成后，只需要將小管放在磁鐵上，在幾秒鐘內復合物被吸到靠近磁鐵的管壁上，然后將上清吸掉即可，而不需要進行離心或過柱，如此輕柔的操作，足以保持亞細胞器的生物學活性。

免疫磁珠分離技術很好的彌補了離心分離法的四點缺陷，但也有其不足之處，即一次分離純化所得到的樣品的體積較小，需要的特異性抗體的量較大。

如果特異性抗原表位被包埋在內部，盡管在分離過程中可采用間接法，但zui終的分離效率可能會降低。并且那些未與靶細胞器相結合的抗體必須借助密度梯度離心或其他的一些手段去除。

因此，如果將傳統(tǒng)的離心法與免疫磁珠法相結合就可以很好的解決各種問題。即對組織或細胞粗提液先進行差速離心，然后將相應的沉淀或上清進行進一步的密度梯度離心。

將收集的比較富集的組分合并，用于免疫磁珠的分離。這樣就可以獲得具有一定數(shù)量的相當純度的細胞器組分顆粒，以便后面的其他分析操作。

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